실험 제목 : Animal cell culture - Stock thawing (HEK293 cell)
실험 재료 : Cell stock, 10% FBS DMEM (혹은 RPMI 등 각 cell에 맞는 media)
실험 내용
액체 질소에 보관 중인 Cell stock을 녹여서 cell culture flask로 옮겨서 키우는 과정이다. Stock을 만드는 과정에서는 삼투압과 온도에 의한 세포 손상을 막기 위해서 천천히 얼리는 것이 중요하지만 thawing 과정에서는 빠르게 녹여서 세포를 안정적인 환경으로 옮겨주는 것이 중요하다.
실험 방법
1. 액체 질소 보관함에서 cell stock을 꺼내 준다.
- 보호장비를 잘 착용하는 것이 좋고, 너무 빠르게 꺼내면 액체질소가 흘러내린다.
- 쇠 막대기로 저 부분이 확실히 결착되었는지 확인하자. 박스채로 액체질소통에 떨어트리는 경우가 종종 발생하며, 해결하려면 액체질소를 다 부어내야 해서 굉장히 번거로워진다.
2. 세포 배양실까지 빠르게 옮긴다.
- 건강한 cell line의 경우 그렇게까지 빠르게 할 필요는 없지만, 예민한 세포들의 경우 대충 할수록 많이 죽고 상태가 안 좋아진다. 특히 Raw264.7 cell들은 최대한 프로토콜대로 하는 것이 좋다.
3. 37도 waterbath에서 녹여준다.
- Waterbath에 뚜껑 부분이 잠기면 contamination 우려가 있으므로 조심해야 한다. 자리를 비우지 말고 녹았는지 바로바로 파악해줘야 한다. 녹으면서 DMSO로 인해서 세포가 손상된다.
4. 얼음 결정이 아주 약간 남아 있는 시점부터 Warming 된 10% FBS DMEM를 10mL 따서 섞어준다.
- 다 녹이고 섞어주는 것이 맞으나 알코올 소독하고 파이펫 팁을 끼는 등의 과정이 있으므로 DMSO 영향을 줄이기 위해서 빨리 섞어준다. Stock을 잘 소독해서 clean bench로 넣어준다.
5. 15mL cornical tube에 옮겨준다.
6. 500 xg에서 3 min centrifuge 해준다.
- Swing rotor를 사용하는 것이 pellet이 바닥에 고르게 생겨서 좋다.
7. Pellet을 확인하고 조심스럽게 media를 suction 해준다.
- DMSO를 더 잘 제거하고 싶으면 과정을 반복하여 wash 해준다.
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8. 10% FBS DMEM 12mL로 resuspension 해준 후 Cell culture flask에 옮겨준다.
- 만약 세포가 충분하지 않으면 75T에서 먼저 culture 하면 좋고 일반적으로는 175T에서 culture 한다.
9. Cell incubator에서 24hr 키운다.
10. 다음 날 계대해준다.
- Passage 1에서 2로는 빨리 넘어가 주는 것이 좋다.
토의
- 건강한 세포라면 몇 시간 후에 확인 시 세포 벽면에 붙어있다. 시간이 지나면 세포 특유의 morphology도 관찰될 것이다.
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