Luciferase assay Protocol (단백질 발현 측정 / 결과 예시 및 template)

실험 제목 : in vitro luciferase assay protocol

 

실험 재료 : Reporter Lysis 5X buffer, scraper, Luminoplate, BCA 실험 재료 ( 소요시간 : 1~2 hr )

 

실험 내용

 

 Substrate인 luciferin과 반응하여 발광하는 luciferase의 특성을 이용하여 단백질의 발현 정도를 측정하는 실험이다. Luciferase 유전자를 DNA 혹은 RNA 등으로 전달한 후 발현하는데 시간이 걸리므로 transfection 후 24 hr 정도가 지난 후에 제대로 된 발현량을 관찰 할 수 있다. Cellular uptake 외에도 endosomal escape, nucleus localization 등의 다양한 요소들이 최종적으로 발현량에 영향을 준다.

 

실험 방법

 

*12well plate 기준

1. Media 제거해주고 DPBS 1ml x 2회 wash.

- Lysis 할 cell이기 때문에 clean bench 밖에서 진행하여도 된다. Suction기를 사용 할 시 1회만 해도 보통 결과에 영향을 주지 않았다. Media가 제대로 제거 되지 않을 시, 추후 전체 단백질 농도가 다르게 나올 수 있으며 DPBS도 잘 제거하여야 sample volume이 통일되서 오차가 줄어든다.

2.  1x reporter lysis buffer 120 ul씩 처리

- Promega 사 제품을 사용하였다. 증류수를 이용하여 1x로 희석하여 사용한다.

(제품 링크 : https://www.promega.kr/products/luciferase-assays/reporter-assays/reporter-lysis-5x-buffer/)

Fig. Promega 사 Reporter Lysis 5X buffer

3. 실온 (RT)에서 3 min incubation.

- 정확히 시간을 지킬 필요는 없지만 너무 천천히 하면 단백질이 분해되서 값이 달라질 수 있다.

 

4. Cell scraper 혹은 파이펫팅을 이용하여 세포를 떼어내고 새로운 1.5 ml tube로 옮겨담아준다.

Fig. 스크래핑 -> 파이펫팅하였다.

 

5. 10,000 g, 7min, 4 ° ⁣C로 centrifuge.

- 온도를 맞춰서 단백질 분해를 최대한 줄인다. Cell lysate를 제거할 목적이므로 조금 더 느린 RPM으로도 pellet을 제거할 수 있다.

 

6. Pellet을 건드리지 않게 상층액만 조심히 새로운 1.5 ml tube로 옮겨담아준다.

- Fixed angle rotor로 centrifuge하면 pellet이 다음과 같이 맨 밑 부분이 아닌 대각선으로 tube에 붙게 된다. 이 때 다음과 같이 파이펫 팁을 사용하면 supernatant만 안전하게 얻어낼 수 있다.

Fig. Supernatant만 안전하게 따는 법

 

7. Lumino-plate에 20ul씩 담아준다. (* 같은 샘플로 BCA도 측정)

- Luminoplate가 아니면 제대로 측정 되지 않는다. BCA assay도 진행하여야 추후에 normalization을 한 값을 얻을 수 있다. 

 

8. Luminometer 혹은 spectrometer를 이용하여 측정.

- Luminometer의 경우 현재 실험실에서는 well당 luciferin을 50ul씩 treat하게 설정되어 있고 다양한 cell line에서 문제 없이 측정되고 있다. 실험 조건에 따라 변경할 수 있을 것이다. Luminometer가 없다면 멀티파이펫을 이용하여 수동으로 넣어준다. 첫 번째 well을 blank로 설정해주면 좋다.

 

실험 결과

 

Excel template 파일

Luciferase assay template.xls

0.04MB

- BCA assay는 standard의 회귀분석을 통하여 Y 절편과 기울기 값을 변경해주어야 정확한 값이 나온다.

 

결과 예시

 

=> 특정 물질의 비율별 전달 효율을 알아 낼 수 있다. 위 예시에서는 1:12까지 통계적으로 유의미한 차이를 보이고 있고 그 이후는 saturation 된 경향을 보여주고 있다. (통계 처리는 표시하지 않았다)