Gel retardation assay - Protocol

실험 제목 : Gel retardation assay

 

실험 재료 : TBE buffer, Agarose gel, Staysafe neucliec acid stain (EtBr로 대체 가능), 6 x loading dye ( 2 h 소요)

 

실험 내용

 

Nucleic acid와 Vector가 complex를 형성하는지 확인 할 수 있다. 이 때 vector의 양을 점점 늘려가면 어떤 비율에서 complex를 형성하여 유전자를 retardation 시키는지 알 수 있다.

 

실험 방법

 

1. TBE buffer 50 ml에 agrose를 0.5 g 넣어준다. ( oligo DNA 를 detection 하기 위해 1% gel을 사용하였다. )

Agarose cel % (w/v)	Size Resolution
0.5	1 kb ~ 30 kb
0.7	800 bp ~ 12kb
1.0	500 bp ~ 10 kb
1.2	400 bp ~ 7kb
1.5	200 bp ~ 3kb
2.0	50 bp ~ 2kb

- 해당 표를 참고하여 맞는 비율을 참고하면 된다. 일반적인 pDNA의 경우 1% gel로 하면 충분하며 oligo의 경우 1.5~2 % gel을 사용하지 않으면 다 빠져나가서 detection이 되지 않을 수 있다.

 

2. 전자레인지로 1분 30초 동안 가열해준다.

- 이 때 랩으로 입구를 감싸주고 구멍을 뚫어서 증발하는 양을 최소화 하면 좋다.

 

3. RT에서 일정시간 식혀준다.

- 너무 식히면 굳어버린다. EtBr이 아니라면 지금 식히지 않고 다음 스텝으로 가도 괜찮지만 불안하다면 조금 식혀주는 걸로..

 

4. Safety nucleic acid를 5 ul 넣어주고 흔들어서 섞어준다.

- 만약 EtBr밖에 없다면 신체에 닿지 않게 매우 조심해준다.

 

5. Mold를 깔고 comb를 꽂아준 뒤에 gel을 천천히 부어준다.

- 빨리 부으면 기포가 생긴다. Gel 농도가 높을 수록 특히 생기기 쉽다.

그림1. 뒤에 꽂혀있는게 Comb이며 밑에 mold가 깔려 있는 상태에서 아직 굳지 않은 gel을 부어준다.

6. RT 혹은 cold room에서 식혀준다.

- RT보단 차갑게 식혀주는 것이 좋다. 칼 같이 이쁜 band가 잘 나올 것이다.

 

7. Naked nucleic acid 및 Nucleic acid / carrier를 비율별로 준비해준다. ( 유전자 1ug , total volume 10ul ~ 20ul가 되게 준비해준다 )

- Total volume이 높으면 well에 loading 할 시 넘치게 된다. 또한 다루는 volume이 2 ul 보다 작다면, dilution을 통해서 파이펫 사용에 의한 오차를 최대한 줄여주면 좋다. 깔끔하고 정확한 데이터를 얻기 위해서는 매우 중요하다.

 

8. Complex를 RT에서 30 min incubation 해준다.

- Complex 형성 조건에 따라 다른 부분이다.

 

9. 6x loading dye를 sample에 넣어준다.

- 10 ul 이면 2 ul의 loading dye를 넣어주면 loading dye의 sample 내 농도가 1x가 될 것이다. 20 ul이면 4 ul를 넣어주면 된다. Loading dye의 역할은 두가지다. Sample이 내려가는 것을 보기 위함과 well에 잘 loading 되게 가라앉게 해주는 역할이다. Band가 좀 찌그러지는 편이라면 loading dye를 더 무거운 molecule이 있는 것을 만들어 사용하면 더 이쁜 band가 나온다.

 

10. 전기 영동기에 gel을 위치시키고 1x TBE buffer를 부어준다.

- 0.5 x TBE buffer도 무관하다. Gel을 옮길 때 Comb를 조심스럽게 뽑아야 well 부분이 손상되지 않는다. 또한 주변의 gel 찌꺼기를 제거해주면 TBE buffer가 덜 더러워진다.

그림 2.

11. Sample을 loading 해준다.

- 자신도 모르게 수전증을 가지고 있는 것을 알게 된다. 왼손으로 오른손을 고정해주어 떨림을 최소화해주자. Well 부분에 mold가 색이 입혀져 있는 제품인 경우 well이 잘 보여서 더 편리하다. 파이펫을 끝까지 누르면 공기로 인해서 sample이 well 밖으로 튀어나올 수 있다.

 

그림 3. Sample loading

 

12. 전기영동기를 작동시킨다. ( 100 V, 30 min으로 하였다. 다른 조건도 상관 없다 )

- 단, Voltage가 너무 높을 경우 열 발생으로 인해서 sample이 손상될 수 있다. Cold room에서 진행하거나 voltage 값을 낮춰주면 된다. 시간은 모든 실험을 고정하는게 나중에 data를 정리 할 때 편하다.

 

13. UV를 통해서 detection 한다.

 

 

실험 결과 및 해석 예시

 

그림4. Gel retardation 실험 예시

Naked 유전자의 경우 저항 없이 gel을 통과한다. 하지만 Polymer의 양을 늘려가면서 점점 well에서 벗어나지 못하게 되고 1:1.5 비율부터는 아예 retardation이 되었다. 또한 비율이 점점 늘어감에 따라 well에서조차 band가 보이지 않게 되는데 이는 complex가 더 condensation 되면서 masking 되기 때문이다.

 

 

TBE buffer recipe : https://notbee.tistory.com/7